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ELISA澳门威尼斯人注册网站检测未知抗体的间接法
浏览次数:770发布日期:2014/12/24
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方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1、 包被:用0.05M PH9.ELISA澳门威尼斯人注册网站牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml.在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。

2、 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。

3、 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml.37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。

4、 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。

5、 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml.

6、 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+"、“-"号表示。也可测OD值:在ELISA澳门威尼斯人注册网站检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,ELISA澳门威尼斯人注册网站以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

方法二 用于:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0、1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6.

三、ELISA澳门威尼斯人注册网站器材

1、 试剂

(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸馏水至1000ml

(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、ELISA澳门威尼斯人注册网站灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。

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