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活性蛋白澳门威尼斯人注册网站怎样提取
浏览次数:121发布日期:2021-12-23

活性蛋白提取澳门威尼斯人注册网站该怎么提取呢?首先大家一起来看看使用说明和操作。


一、澳门威尼斯人注册网站说明


本澳门威尼斯人注册网站用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取具有活性的全蛋白, 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液

Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞,作用温和,提取过程简便。获得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的测定的等后续研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本澳门威尼斯人注册网站中包括这两种酶的抑制剂。 应用方面:可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性测定等后续研究。


二、操作步骤


Ⅰ、实体组织蛋白的提取


1、在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制剂,1 μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF,混匀。冰上保存数分钟待 用


2、 每 100mg 固体组织置于培养皿中,手术剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小块,加入 0.5~1 mL 冷 Lysis Buffer,玻 璃匀浆器上下手动匀浆 15 次,注意低温操作;


3、取组织匀浆液转移到 1.5mL 预冷的离心管,离心 10000 转/分,4℃离心 5 min;


4、取上清转移至新的预冷的离心管中,即为全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);


5、分装保存于-70℃,避免反复冻融。


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Ⅱ、培养细胞蛋白提取


1、 贴壁培养的细胞,吸去培养基后,加入 10mL/150mm 培养板的冷 PBS 洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液;


2、  悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞,将细胞及培养液移至离心管中,1000 转/分离心 10 min,再用10mL/150mm 培养板的冷 PBS,1000 转/分离心 5 min 洗两次;


3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制剂,1μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF(用户自配:浓度 100mM, 溶于异丙醇),混匀。冰上保存数分钟待用


4、 在上述培养板或离心管的细胞中,加入上述配制好的冷 Lysis Buffer


5、冷室或冰上操作,贴壁细胞用细胞刮子刮下,皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中;悬浮培养或裂解前刮下的贴壁细胞皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中;


6、置于 4℃摇床平台上,温和振荡 15 min;


7、14,000rpm,4℃离心 15min,取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);


8、  分装保存于-70℃,避免反复冻融。


三、注意事项


所有接触样品的用具及试剂均需预冷。大家在提取蛋白后,如有必要,可透析除去表面活性剂。

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